Главная -> Публикации ->

Саратиков А.С., Ахмеджанов Р.Р., Бакибаев А.А., Хлебников А.И.*, Новожеева Т.П., Быстрицкий Е.Л. Регуляторы ферментативных систем детоксикации среди азотсодержащих соединений. – Томск, 2002

К разделу 4.1

4.2. Конструирование новых лигандов цитохрома Р-450 среди соединений мочевины

Основное содержание раздела опубликовано в работе:

Хлебников А.И., Ахмеджанов Р.Р., Набока О.И., Бакибаев А.А., Тартынова М.И., Новожеева Т.П., Саратиков А.С. // Хим.-фарм. журн. - 2005. - Т. 39, № 1. – С.19-21.

Для создания набора исходных фрагментов при конструировании новых эффективных лигандов использовали субстраты цитохрома Р-450 I и II типа, образующие с микросомальным гемопротеидом устойчивые ферментсубстратные комплексы (раздел 2.3).

С помощью рассмотренного в разделе 4.1. алгоритма выполнен de novo дизайн химических структур 1-3 (рис. 59), обладающих сродством к цитохрому Р-450 с последующим их синтезом и спектроскопическим определением констант диссоциации ферментсубстратных комплексов. Это позволило проверить корректность внеэкспериментальной оценки величин биологической активности новых соединений с помощью метода ФМ.

Подход к de novo дизайну предполагает исследование набора физико-химических характеристик фрагментов, важных для молекулярного распознавания. В качестве таких дескрипторов были выбраны молярная рефракция и гидрофобность, рассчитанные по атомным инкрементам. Весовые коэффициенты дескрипторов считали равными w_r = 0,00032, w_h = 0,2.

De novo дизайн осуществляли со следущими значениями параметров алгоритма (см. раздел 4.1): d_max = 0,2, C_max = 3.

1	p=0,124
2	p=0,003
3	p=0,057

Рис. 59. Химические структуры субстратов цитохрома Р‑450, полученные в результате конструирования.

Комплексообразование цитохрома Р-450 с лигандом 1 сопровождается появлением спектральных изменений I типа (l_min = 425 нм, l_max = 385 нм), а с лигандами 2 и 3 – спектральных изменений II типа (l_min = 393–395 нм, l_max = 427–428 нм), табл. 36. Дифференциальные спектры поглощения комплексов изображены на рис. 60 (а, б), зависимости амплитуды спектральных изменений от концентрации субстратов – на рис. 61, 62, 63. Наблюдаемый тип спектральных изменений соответствует QSAR-модели, использованной при конструировании и определении величин pK_s¢. Прочность образуемых ферментсубстратных комплексов весьма высока: в случае субстратов II типа (2 и 3) экспериментально определённая величина pK_s составляет порядка 10^-6 М, а для субстрата I типа (1) она имеет порядок 10^-7 М (табл. 36).

Для соединений 1-3 (рис. 59), полученных в результате конструирования, в табл. 37 приведены значения прогноза биологической активности pK_s и pK_s¢. Величины pK_s¢ гликолурила 1 найдены по количественному соотношению (QSAR) для субстратов I типа, а соединений 2, 3 – по QSAR для субстратов II типа. Эти характеристики далее сопоставлялись с экспериментально определёнными константами диссоциации ферментсубстратных комплексов.

Отклонение экспериментально определённых pK_s от значений pK_s¢ составляет в среднем 0,41. Это позволяет считать вполне удовлетворительным качество прогноза активности при выполненном de novo дизайне субстратов цитохрома Р-450.

Рис. 60. Дифференциальные спектры поглощения арилалкилмочевин 2, 3 (а) и гликолурила 1 (б), концентрация цитохрома Р-450 5,0 нмоль/мл. Толщина кюветы 1,00 см.

Рис. 61. Зависимости амплитуды спектральных изменений DА от концентрации С субстрата 1 в координатах Лайнуивера-Берка. Концентрация цитохрома Р-450 4,5 нмоль/мл. Толщина кюветы 1,00 см; r = 0,99.

Рис. 62. Зависимости амплитуды спектральных изменений DA от концентрации С субстрата 2 в координатах Лайнуивера-Берка. Концентрация цитохрома Р‑450 4,5 нмоль/мл. Толщина кюветы 1,00 см.

Рис. 63. Зависимости амплитуды спектральных изменений DA от концентрации С субстрата 3 в координатах Лайнуивера-Берка. Концентрация цитохрома Р‑450 4,5 нмоль/мл. Толщина кюветы 1,00 см.

Таблица 36

Характеристики ферментсубстратных комплексов

соединений 1–3 (Рис.59) с цитохромом Р-450

Соединение	Тип спектральных изменений (lmin , lmax, нм)*	Ks**, моль/л	N
1	I (425, 385)	5,23(18) ×10^–7	5
2	II (395, 427)	4,92(12) ×10^–6	7
3	II (393, 428)	1,53(7) ×10^–6	6

* Погрешность в определении положений минимумов и максимумов составляла 1–2 нм.

** В скобках указаны стандартные отклонения в единицах последнего разряда.

Таблица 37

Экспериментальные и вычисленные значения рК_s соединений 1-3 (рис. 59)

Соединение	рКs		– рКs
1	6,29	6,94	0,65
2	5,59	5,12	-0,47
3	5,31	5,19	-0,12

Следует отметить, что дифференциальные спектры поглощения, характерные для комплексов соединений 2 и 3, не наблюдаются после предварительного добавления метирапона или клотримазола в обе кюветы спектрофотометра в насыщающих концентрациях (1 мM и 3 мкМ соответственно), что говорит о наличии конкуренции за связывание с активным центром гемопротеида между исследуемыми лигандами 2, 3 и метирапоном или клотримазолом. Метирапон [254, 255] и клотримазол [114] известны как лиганды гемовой части цитохрома Р-450, избирательно связывающиеся с изоформой 2B1 в фенобарбиталиндуцированных микросомах печени крыс. Отмеченное обстоятельство, а также весьма низкие значения K_s ферментсубстратных комплексов соединений 2 и 3 дают основание сделать вывод об избирательном характере их взаимодействия с основной фенобарбиталиндуцированной изоформой цитохрома Р-450 и позволяет рассматривать соединения 2 и 3 как потенциальные ингибиторы каталитической активности 2B1.

Предварительное добавление субстрата I типа - гликолурила 1 в насыщающей концентрации в кюветы спектрометра приводит к исчезновению спектральных изменений I типа, характерных для гексобарбитала. Последний известен как лиганд апопротеиновой части гемопротеида, метаболизм которого также катализируется изоформой 2B1 [2].

Таким образом, на основе ранее полученных количественных моделей «структура-константа диссоциации» для исследованных азотсодержащих соединений с использованием их молекулярных фрагментов с помощью эффективного алгоритма сконструированы и получены соединения 1-3 – субстраты микросомального цитохрома Р-450 печени с заранее рассчитанным уровнем сродства к гемопротеиду. Проведенное спектральное исследование ферментсубстратных комплексов 1-3 с цитохромом Р-450 в указанных условиях эксперимента, сравнение расчётных и экспериментальных значений констант диссоциации сконструированных de novo веществ 1-3 свидетельствуют о перспективности метода «фронтальных многоугольников» как эффективного способа создания новых субстратов цитохрома Р-450 и внеэкспериментальной оценки их свойств.

Раздел 4.3 и Заключение не публикуются на сайте