Главная -> Публикации ->
Саратиков А.С., Ахмеджанов Р.Р., Бакибаев А.А., Хлебников А.И.*, Новожеева Т.П., Быстрицкий Е.Л. Регуляторы
ферментативных систем детоксикации среди
азотсодержащих соединений. – Томск, 2002
4.2. Конструирование новых лигандов цитохрома Р-450 среди соединений мочевины
Основное
содержание раздела опубликовано в работе: |
Хлебников А.И., Ахмеджанов Р.Р., Набока О.И., Бакибаев А.А., Тартынова М.И., Новожеева Т.П.,
Саратиков А.С. // Хим.-фарм.
журн. - 2005. - Т. 39,
№ 1. – С.19-21. |
Для создания набора исходных
фрагментов при конструировании новых эффективных лигандов
использовали субстраты цитохрома Р-450 I и II типа, образующие с микросомальным гемопротеидом устойчивые
ферментсубстратные комплексы (раздел 2.3).
С помощью рассмотренного
в разделе 4.1. алгоритма выполнен de novo дизайн химических структур 1-3 (рис. 59),
обладающих сродством к цитохрому Р-450 с последующим
их синтезом и спектроскопическим определением констант диссоциации ферментсубстратных комплексов. Это позволило проверить
корректность внеэкспериментальной оценки величин
биологической активности новых соединений с помощью метода ФМ.
Подход к de novo дизайну предполагает исследование
набора физико-химических характеристик фрагментов, важных для молекулярного распознавания.
В качестве таких дескрипторов были выбраны молярная рефракция и гидрофобность,
рассчитанные по атомным инкрементам. Весовые коэффициенты дескрипторов считали
равными wr = 0,00032, wh = 0,2.
De novo дизайн осуществляли со следущими значениями параметров алгоритма (см. раздел 4.1):
dmax = 0,2, Cmax = 3.
1 |
|
2 |
|
3 |
|
Рис. 59.
Химические структуры субстратов цитохрома Р‑450,
полученные в результате конструирования.
Комплексообразование цитохрома
Р-450 с лигандом 1
сопровождается появлением спектральных изменений I типа (lmin = 425 нм, lmax = 385 нм), а с лигандами
2 и 3 – спектральных изменений II типа
(lmin = 393–395 нм, lmax = 427–428 нм), табл. 36.
Дифференциальные спектры поглощения комплексов изображены на рис.
60 (а, б), зависимости амплитуды спектральных изменений от концентрации
субстратов – на рис. 61, 62, 63. Наблюдаемый тип спектральных изменений соответствует QSAR-модели,
использованной при конструировании и определении величин pKs¢.
Прочность образуемых ферментсубстратных комплексов
весьма высока: в случае субстратов II типа (2 и 3) экспериментально определённая
величина pKs
составляет порядка 10-6 М, а для субстрата I типа
(1) она имеет порядок 10-7
М (табл. 36).
Для соединений 1-3 (рис. 59),
полученных в результате конструирования, в табл. 37
приведены значения прогноза биологической активности pKs и pKs¢. Величины pKs¢ гликолурила
1 найдены по количественному соотношению (QSAR) для
субстратов I типа, а соединений 2, 3 – по
QSAR для субстратов II типа. Эти характеристики далее сопоставлялись с
экспериментально определёнными константами диссоциации ферментсубстратных
комплексов.
Отклонение экспериментально определённых pKs от значений pKs¢ составляет в среднем 0,41. Это позволяет считать вполне
удовлетворительным качество прогноза активности при выполненном de novo дизайне субстратов цитохрома Р-450.
Рис. 60. Дифференциальные спектры поглощения арилалкилмочевин 2, 3 (а) и гликолурила
1 (б), концентрация цитохрома Р-450 5,0 нмоль/мл. Толщина кюветы 1,00 см.
Рис. 61. Зависимости амплитуды спектральных изменений DА
от концентрации С субстрата 1 в координатах
Лайнуивера-Берка. Концентрация цитохрома
Р-450 4,5 нмоль/мл. Толщина кюветы 1,00 см; r = 0,99.
Рис. 62. Зависимости амплитуды
спектральных изменений DA от концентрации С
субстрата 2 в координатах Лайнуивера-Берка. Концентрация цитохрома
Р‑450 4,5 нмоль/мл. Толщина кюветы 1,00 см.
Рис. 63. Зависимости амплитуды спектральных изменений DA от концентрации С субстрата
3 в координатах Лайнуивера-Берка. Концентрация цитохрома Р‑450 4,5 нмоль/мл.
Толщина кюветы 1,00 см.
Характеристики ферментсубстратных комплексов
соединений 1–3 (Рис.59) с цитохромом Р-450
Соединение |
Тип спектральных изменений (lmin , lmax, нм)* |
Ks**, моль/л |
N |
1 |
I (425, 385) |
5,23(18)
×10–7 |
5 |
2 |
II (395, 427) |
4,92(12) ×10–6 |
7 |
3 |
II
(393, 428) |
1,53(7) ×10–6 |
6 |
*
Погрешность в определении положений минимумов и максимумов составляла 1–2 нм.
** В скобках
указаны стандартные отклонения в единицах последнего разряда.
Экспериментальные и вычисленные
значения рКs
соединений 1-3 (рис. 59)
Соединение |
рКs |
|
|
1 |
6,29 |
6,94 |
0,65 |
2 |
5,59 |
5,12 |
-0,47 |
3 |
5,31 |
5,19 |
-0,12 |
Следует отметить, что дифференциальные
спектры поглощения, характерные для комплексов соединений 2 и 3, не наблюдаются
после предварительного добавления метирапона или клотримазола в обе кюветы спектрофотометра в насыщающих
концентрациях (1 мM и 3 мкМ
соответственно), что говорит о наличии конкуренции за связывание с активным
центром гемопротеида между исследуемыми лигандами 2, 3 и
метирапоном или клотримазолом.
Метирапон [254, 255] и клотримазол [114] известны как лиганды гемовой части цитохрома Р-450,
избирательно связывающиеся с изоформой 2B1 в фенобарбиталиндуцированных
микросомах печени крыс. Отмеченное обстоятельство, а также весьма низкие значения
Ks ферментсубстратных комплексов соединений 2 и 3 дают основание сделать вывод об избирательном характере их
взаимодействия с основной фенобарбиталиндуцированной изоформой цитохрома Р-450 и позволяет рассматривать соединения 2 и 3 как потенциальные ингибиторы каталитической активности 2B1.
Предварительное
добавление субстрата I типа - гликолурила
1 в насыщающей концентрации в кюветы
спектрометра приводит к исчезновению спектральных изменений I типа, характерных для гексобарбитала. Последний известен как лиганд
апопротеиновой части гемопротеида,
метаболизм которого также катализируется изоформой 2B1 [2].
Таким образом, на основе ранее полученных количественных
моделей «структура-константа диссоциации» для
исследованных азотсодержащих соединений
с использованием их молекулярных фрагментов с помощью эффективного алгоритма
сконструированы и получены соединения 1-3 – субстраты микросомального цитохрома Р-450
печени с заранее рассчитанным уровнем сродства к гемопротеиду.
Проведенное спектральное исследование ферментсубстратных
комплексов 1-3 с цитохромом Р-450 в указанных условиях эксперимента,
сравнение расчётных и экспериментальных значений констант диссоциации сконструированных
de novo веществ 1-3 свидетельствуют о перспективности метода «фронтальных
многоугольников» как эффективного способа создания новых субстратов цитохрома Р-450 и внеэкспериментальной
оценки их свойств.
Раздел 4.3 и Заключение не
публикуются на сайте